Mugello zeigte sich auch gegenüber den MotoGP-Fahrern freundlich im Warm-Up und bot mit 18°C Luft- und 29°C Streckentemperatur beste Bedingungen. Valentino Rossi nutzte die erste Runde seines Warm-Up, trotz schwieriger Tage, für einen Gruß an die Fans, bevor er sich auf seine Rennvorbereitung konzentrierte. Der Italiener schien etwas für die Ducati gefunden zu haben, doch die Bestzeit legte Marco Simoncelli hin.

Dabei hatte der Italiener bis Ablauf der 20 Minuten stetig auf Rang vier gelegen, erst mit seinem letzten Versuch gelang ihm eine 1:48.430 Runde und damit verdrängte er Landsmann Andrea Dovizioso mit acht Tausendstel Vorsprung von der Spitze. Casey Stoner hatte auf eine letzte schnelle Runde verzichtet und reihte sich als Dritter ein, nachdem er für die meiste Zeit des Warm-Up an der Spitze gelegen hatte.

Das Warm-Up bot zuerst einen munteren Wechsel an der Spitze mit Jorge Lorenzo, Nicky Hayden und Ben Spies, die sich während der ersten zehn Minuten vorn abwechselten. Dani Pedrosa war der erste Fahrer, der tiefe 1:49 Zeiten hinlegte. Der Spanier legte wurde am Ende Sechster.

Factory Yamaha Fahrer Ben Spies reihte sich auf Platz vier ein, damit schlug der Amerikaner auch im Warm-Up Teamkollege Jorge Lorenzo. Nicky Hayden wurde Siebenter und war erneut der beste Ducati-Fahrer. Colin Edwards, Valentino Rossi und Hiroshi Aoyama komplettierten die Top-10.

Die 20 Minuten verliefen ohne Sturzzwischenfälle und auch von technischen Problemen blieben die 16 Starter minus Loris Capirossi verschont.