Dani Pedrosa sicherte sich in Brünn auch im zweiten freien Training die Bestzeit vor sienem Teamkollegen Casey Stoner. Zwar konnte er mit 1:56.454 Minuten seine Zeit aus dem ersten Training nicht erreichen, dennoch blieb der kleine Spanier 0,377 Sekunden vor Stoner. Marco Simoncelli, der am Morgen noch stürzte, machte das Honda-Trio an der Spitze perfekt. Lediglich 0,038 Sekunden trennten den Italiener vom amtierenden Weltmeister Jorge Lorenzo, der auf den vierten Platz kam.

Hinter Lorenzo reihte sich Andrea Dovizioso auf dem fünften Platz ein. Lorenzos Teamkollege Ben Spies kam auf den sechsten Platz. Valentino Rossi hatte lange Zeit Probleme mit seiner Ducati. Die Strecke von Brünn kommt mit den langen Kurvenradien der Desmosedici nicht entgegen. Dennoch fand er eine Sekunde und schob sich auf den siebenten Platz. Erst in letzter Minute verdrängte er Alvaro Bautista auf den achten Platz.

Cal Crutchlow, der die Strecke bereits aus der Superbike-WM kennt, erreichte mit einer Zeit von 1:57.859 Minuten die neunte Position. Der Wildcard-Pilot John Hopkins beeindruckte erneut, denn er rundete im zweiten freien Training die Top-10 ab.

Als einziger stürzte in dieser Session Randy de Puniet, der typisch für die Ducati über das Vorderrad stürzte. In der Kurvenmitte verlor er den Grip an der Front und rutschte über den Asphalt.